A cromatografia líquida de alto desempenho inclui principalmente sistema de injeção, sistema de infusão, sistema de separação, sistema de detecção e sistema de processamento de dados. A seguir serão apresentadas suas respectivas composições e características.
1. O sistema de injeção geralmente utiliza um injetor de diafragma ou uma câmara de injeção de alta pressão para completar a operação de injeção, com volume de injeção constante. Isto é benéfico para melhorar a reprodutibilidade da análise da amostra.
2. O sistema de infusão consiste em três partes: uma bomba de alta pressão, um reservatório de fase móvel e um medidor de gradiente. A pressão geral de uma bomba de alta pressão é l. 47-4.4X107Pa, vazão ajustável e estável. Quando a fase móvel de alta pressão passa pela coluna cromatográfica, pode reduzir o efeito de difusão da amostra dentro da coluna, acelerar a velocidade de movimento dentro da coluna, melhorar o grau de separação e recuperar a amostra. Benéfico para manter a atividade biológica da amostra. O erro de armazenamento da fase móvel e o analisador de gradiente podem alterar a fase móvel de acordo com as propriedades da fase estacionária e da amostra, incluindo a alteração da polaridade, força iônica e valor de pH do eluente, ou usar inibidores competitivos ou agentes desnaturantes. Isto permite a separação eficaz de múltiplas substâncias, mesmo que haja apenas um conjunto de diferenças ou isómeros.
3. O sistema de separação inclui colunas cromatográficas, tubos de conexão, termostatos, etc. O comprimento da coluna cromatográfica é geralmente 10-50cm (se forem necessários dois, um tubo de conexão pode ser adicionado entre eles), com um diâmetro interno de 2-5mm, feito de aço inoxidável de alta qualidade ou tubo de vidro de parede espessa ou liga de titânio. Existe uma fase fixa com tamanho de partícula de 5-10 μm (composta por uma matriz e um fixador). A matriz na fase estacionária é feita de resina de alta resistência mecânica ou sílica gel, que possui inércia (como a sílica gel alcalina foi removida), porosidade (tamanho de poro de até 1000?) e grande área superficial específica. Eles são revestidos mecanicamente para acoplamento (semelhante à preparação de fases estacionárias de cromatografia gasosa) ou acoplados quimicamente a vários genes (como fosfato, amino quaternário, hidroximetil, fenil, amino ou vários comprimentos de cadeia de carbono alquil) ou compostos orgânicos ligantes. . Portanto, essa estrutura relativa fixa possui boa seletividade. Por exemplo, após o acoplamento da aglutinina de ervilha (PSA) na superfície da sílica gel porosa, as glicoproteínas nos fibroblastos podem ser isoladas. Além disso, o plasmídeo baseado em fase estacionária é pequeno e o leito da coluna é fácil de atingir um estado uniforme e denso. É fácil reduzir o efeito de difusão das correntes parasitas. O tamanho da partícula da matriz é pequeno, os microporos são rasos e a transferência de massa da amostra na área microporosa é curta. Eles são benéficos para reduzir a largura de banda e melhorar a resolução. De acordo com a análise da teoria do efeito da coluna, quanto menor o tamanho da partícula da matriz e maior o número teórico N da placa. Isto prova ainda que quanto menor for o tamanho das partículas da matriz, maior será o grau de separação. Além disso, os termostatos de cromatografia líquida de alto desempenho podem ajustar a temperatura da temperatura ambiente para 60 graus, encurtando o tempo de análise aumentando a taxa de transferência de massa.
4. Os detectores comumente usados para sistemas de detecção de HPLC incluem detectores ultravioleta, detectores de índice de refração e detectores de fluorescência.
(1) O detector UV é adequado para detectar amostras com características de absorção sob luz ultravioleta (ou visível). Suas características: ampla gama de aplicações (como proteínas, ácidos nucléicos, aminoácidos, nucleotídeos, peptídeos, hormônios, etc.); Alta sensibilidade (limite de detecção de 10-10g/ml); Ampla faixa linear; Não é sensível a mudanças de temperatura e vazão; Pode detectar amostras eluídas com soluções gradientes.
(2) O detector de índice de refração diferencial pode ser usado para detectar todos os componentes da amostra com índices de refração diferentes daqueles detectados pelo detector de fase móvel. Actualmente, a maioria dos compostos de hidratos de carbono são detectados utilizando este sistema de detecção. O sistema tem forte universalidade e operação simples, mas baixa sensibilidade (limite de detecção de 10-7g/ml), e alterações na fase móvel podem causar alterações no índice de refração. Portanto, não é adequado para análise de traços nem para detecção de amostras de eluição gradiente.
(3) O detector de fluorescência só é adequado para a determinação de compostos orgânicos fluorescentes (como hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, aminoácidos, aminas, vitaminas e certas proteínas) sob certas condições, com base na intensidade de fluorescência e concentração da luz emitida. Sua sensibilidade é muito alta (o limite de detecção é 10-12~10-14g/ml) e pode ser usado para análise de traços e detecção em trabalhos de eluição de gradiente.
5. O sistema de processamento de dados pode coletar, armazenar, exibir, imprimir e processar dados de teste para separar amostras e pode executar corretamente o trabalho de preparação ou identificação